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共聚焦显微技术是近十几年迅速发展起来的一项高新研究技术，应用范围广泛。近日，得克萨斯农工大学（Texas a & m AgriLife）和其它各个部门合作发现，共聚焦技术可应用于微生物领域。
图1 Brian Shaw 博士利用共聚焦显微镜的各种成像方式进行研究。（图片来源：Texas A&M AgriLife / Michael Miller）
Brian Shaw博士，Texas a & m AgriLife生物与农业工程学院植物病理学与微生物学系教授，是一位共聚焦显微镜方面的专家。他不仅在自己的研究中应用了这种最先进的技术，而且还鼓励本科生，研究生以及其他研究人员利用这种技术来推进团队的科研工作。
什么是共聚焦显微镜
Shaw解释说：“共聚焦显微镜与传统显微镜相比，有几个优势，包括控制景深，减少或消除焦平面上形成图像时的失焦模糊等。”
他说：“它还能让你与活细胞一起工作，实时观察它们的变化，以及从厚样本中收集连续切片。”此外，它可以产生一个近乎3D 的细胞图像，以便于不同的角度观察它。
Shaw的先进共焦显微镜允许广泛的成像模式，其位于Texas a & m AgriLife的植物病理学和微生物学大楼。
它是一台Olympus FV3000共聚焦激光扫描显微镜，具有四个探测器和六条激光线，可以同时成像几乎任何荧光团。此外，它能够完全自动对焦，允许延时成像数小时并不失焦，显微镜的精密电动工作台可以同时对各种标本进行多点延时。
利用共聚焦显微镜确定病原体
根据期刊《Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology》的研究结果，超过80% 的农作物疾病是由真菌或真菌病原体引起的。这些疾病导致数十亿美元的农作物损失，并威胁到粮食安全。
Shaw说，他们团队所做的大部分研究都与真菌有关，包括确定真菌生长发育过程中的细胞机制以及真菌病原体如何工作。
此外，他说：“我们正在研究真菌孢子的表面特征以及它们是如何影响孢子传播的。”真菌孢子可处于休眠状态，这些微生物在休眠期穿越距离和时间传播。
Shaw说，丝状真菌极化生长，对植物和人类产生一定影响，因此需要了解菌丝是如何形成的。菌丝是丝状真菌营养体的基本单位，通常由一连串细长的细胞组成，。细长的丝状细胞只在高度极化的顶端生长，它们的生长拥有一个生长点，然后持续生长。
“我们的实验室研究了真菌菌丝生长和发育过程中细胞结构的时间和空间变化，”他说，“利用共聚焦显微镜，我们发现重要的玉米病原菌——小麦炭疽病菌的孢子是不对称的。而这些孢子只能一面附着在它们的新宿主身上。”
Shaw说，由于附着在新宿主身上是开始玉米病害循环的必要条件，这一发现为破坏玉米真菌病害确定了一个新的重要目标。
他说：“借助这种高分辨率、近乎3D 的图像，我们能够推断附着部位和真菌病原体感染部位之间的相关性。共聚焦显微镜使我们能够以前所未有的细节水平来观察这些结构及其组件。现在我们可以更好地了解真菌是如何生长的，并确定特定真菌的菌丝及其在疾病发生中的作用。”
图2 利用共聚焦显微镜拍摄的真菌孢子。（图片来源：Texas A & M AgriLife/Michael Miller）
本科生和研究生使用共聚焦显微镜
在Shaw实验室，植物病理学和微生物学系的研究Oli Bedsole说，他利用共聚焦显微镜研究不同的蛋白质如何在真菌中相互作用和联系。
Bedsole说：“我正在研究真菌孢子中的粘合剂，这种粘合剂可以使真菌附着在植物上，然后感染植物，比如玉米。因此，共聚焦显微镜的分辨率是非常重要的，它使我能够看到粘合剂的位置、特定蛋白质的位置以及它们如何相互作用。”
Bedsole说，他从 Shaw 和其他实验室成员那里学到了共聚焦显微镜的基础知识，然后通过研究生课程《光学显微镜理论与应用》接受了进一步的培训。
他说：“我们几乎只拍摄活体样本，其分辨率令人难以置信。共聚焦显微镜让我们能够3D观察细胞，给我们一个独特的视角和清晰度。它也是一个强大的工具，可以帮助我们向其他人传播科学知。”
Bedsole 的同事，本科生Mary Cowser表示，来自共聚焦显微镜的图像有助于将科学带入生活。
她说：“通过染色真菌结构的不同部分来创建色彩鲜艳的图像，使我们能够看到鲜艳的真菌结构。这种实时生长的3D 结构可以让我们深入了解它们的运作方式。并且有助于我们更多地了解病原体及其机制，从而推进环境科学的发展。”
Bedsole，Cowser 和其他学生在Shaw的实验室接受专门的培训和做与生物科学技术有关的实验。
Shaw说：“共聚焦显微镜在微生物学和环境科学领域有着广泛的应用。对环境科学专业的学生进行相关技术的培训，可以为他们提供额外的经验和专业知识。如果他们从事的职业与环境中的生物问题有关，那么他们在实验中将获得丰富经验。”
共聚焦显微镜应用于在Texas a & m AgriLife的多个学科
Shaw表示，除了在植物病理学、微生物学和整个生物环境科学领域的应用之外，共聚焦显微镜还有益于其他学科。
Shaw和他的团队与其他科研部门的研究人员合作，跨学科和多学科地使用这种技术来促进科学。
例如，美国艺术与科学学院生物系教授Matthew Sachs博士和研究生Matthew Breuer一直在使用共聚焦显微镜来研究对抗真菌病原体的新方法。
在他们正在研究的真菌病原体中，新型隐球菌导致每年大约18.1万人死，而新型隐球菌脑膜炎引起的脑部感染主要发生在撒哈拉以南非洲。
Sachs说，在他的研究中，使用共聚焦显微镜研究舍曲林的抗真菌效果至关重，舍曲林是一种常用的抗抑郁药物。
他说：“治疗的稀缺性和对现有治疗方法日益增长的耐药性，突出了开发或鉴定适合临床使用的新型抗真菌药物的必要性。我们以前的研究已经表明舍曲林具有抗真菌的特性，将现有的 FDA 批准的化合物如舍曲林重新用作抗真菌药物可能是一个有效的策略。”
Sachs 和他的团队使用共聚焦显微镜来获得活性隐球菌细胞的高分辨率图像，并观察它们是如何受舍曲林的影响的。
“我们与Shaw博士合作获得的这些图像对于指导我们的研究以及帮助我们发现药物如何对抗真菌病至关重要。”他说。
Pei说：“以前在生物打印技术中，挤压压力和针径对细胞活力影响的研究已经使用了动物细胞，但是以前没有关于它们如何使用植物或藻类细胞影响细胞活力的报道。细胞数量是细胞活力的主要指标，我们的研究小组使用共聚焦显微镜来测量3D 打印样本的细胞数量。”
在另一项与肖氏实验室的合作项目中，工程学院工业与系统工程系教授Z. J. Pei博士、生物学系副教授Hongmin Qin博士等利用植物或藻类细胞进行生物打印的相关研究，使用了共聚焦显微镜。
Pei说：“以前在生物打印技术中，挤压压力和针径对细胞活力影响的研究已经使用了动物细胞，但是以前没有关于它们如何使用植物或藻类细胞影响细胞活力的报道。细胞数量是细胞活力的主要指标，我们的研究小组使用共聚焦显微镜来测量3D 打印样本的细胞数量。”
“利用藻类进行生物打印：挤压压力和针直径对打印样品中细胞数量的影响”的研究结果发表在美国机械工程师学会出版的期刊《Journal of Manufacturing Science and Engineering》上。
Pei说，了解挤压压力和针径对藻类细胞数量的影响趋势将有益于藻类印刷。
Shaw和Pei还在合作开发3D 打印真菌定居生物废弃物的技术，如使用稻壳或稻草用作建筑材料。
环境微生物组研究日益重要
Sanjay Antony-Babu博士是植物病理学和微生物学系的助理教授，他利用共聚焦显微镜掌握更多“病原生物组”的前沿知识，即微生物组如何影响引起植物疾病的土壤真菌。
Antony-Babu与德州农工农业生命研究院植物病理学家Tom Isakeit深度合作，“我们正在调查镰刀菌的病原体，这种真菌会导致包括棉花在内的各种作物枯萎。”
此外，“这种植物真菌是一个全球性问题，在全球范围内造成棉花作物的损害和经济损失。我们正在研究哪些细菌可能附着在这些致病真菌上，作为宿主为它们提供营养。”
Antony-Babu认为，土壤微生物非常复杂，一克土壤含有超过100亿个细菌。
“土壤中的任何生物都不是‘一座孤岛’。直到最近，我们才能够以群体而不是个体的方式来研究它们。共聚焦可视化是我们研究微生物的主要方法。” Antony-Babu团队使用一种真菌诱饵技术，其中病原真菌对细菌有自然吸引力。
他说：“我们还利用分子和成像技术——DNA/RNA 测序方法、基于培养物的分析和共聚焦成像——来找出哪些生物体直接相互作用引发植物疾病。”
Shaw还与植物病理学和微生物学系教授Jeanmarie Verchot博士合作，她的研究重点是病毒与宿主的相互作用，并利用共聚焦显微镜记录病毒在植物中的复制过程。
Shaw说：“真菌是我们周围环境微生物群的重要组成部分。” 他指出，真菌通过降解有机废物在营养循环中发挥作用，并导致许多植物和动物生病。“还有毒性真菌孢子威胁建筑环境中空气质，因此真菌每天都会影响我们所有人。”
他说，了解真菌如何利用先进的共聚焦显微镜在环境中繁殖和生长，是人类健康和繁荣的关键——也是生物环境科学的一个重要组成部分。
新闻链接：
https://phys.org/news/2022-11-environmental-microbiome-confocal-microscopy.html
