一种新型超分辨化学显微镜

（左）聚焦离子束 (FIB) 图案化 ITO 的扫描电子显微镜图像。（右）相同 FIB 图案化 ITO 的超分辨单分子 ECL 图像。图片来源：浙江大学

       化学和生物学中的传统实验研究两者的行为，但对科学家来说，观察、操纵和测量单个分子的化学反应一直是一项持久的科学挑战。

       为应对这一挑战，浙江大学化学系冯建东教授致力于开发跨学科的单分子技术和仪器，以观察溶液中的单分子化学反应。最近，冯教授和他的同事设计了一种新技术，可以以超高的空间分辨率直接成像溶液中的单分子电化学反应。该技术在化学成像和生物成像领域具有重要应用，例如以纳米分辨率成像微结构和细胞。该研究结果作为封面发表在 8 月 11 日的《自然》杂志上。

       与荧光成像相比，电化学发光 (ECL) 成像不需要使用激发光，因此背底最小。ECL 是体外免疫诊断的重要工具，需要超高灵敏度来分辨弱信号。目前，ECL领域面临两大挑战。首先，对于单分子检测来说，ECL 信号可以在微弱甚至单分子水平上进行测量和成像，这对单分子分析至关重要。其次，如果能够开发出超分辨率ECL显微镜——突破光学衍射极限的超高时空成像——对化学和生物成像具有重大意义。

       在过去的三年里，冯和他的团队一直致力于解决这两个主要问题。他们开发了一个组合的宽场光学成像和电化学记录系统，并建立了一个高效的 ECL 控制、测量和成像设置。他们对单分子 ECL 反应进行了第一次宽场成像，并在此基础上实现了第一次超分辨率 ECL 成像。这种单分子ECL显微镜无需任何光激发，即可实现单分子超分辨率成像，在化学测量和生物成像方面具有巨大的应用潜力。

       为什么在 ECL 过程中很难在空间上捕获单分子信号？这主要归因于单分子反应难以控制、跟踪和检测的实际情况。冯说：“单分子化学反应伴随着极弱的光、电和磁信号变化，化学反应的过程和发生化学反应的位置是随机的”。

单个活细胞的超分辨率 ECL 图像。图片来源：浙江大学

       为此，冯和他的同事建立了一个灵敏的检测系统，可以捕获单分子反应后产生的发光信号。“对单个反应进行成像需要对单个反应事件进行空间和时间隔离，”冯说。研究团队的博士研究生董金润说：“在我们的案例中，这是通过使用稀释溶液和快速相机采集来实现的。”

       显微镜是材料科学和生命科学的重要工具。传统的光学显微镜可以在数百纳米及以上的尺度上工作，而高分辨率电子显微镜和扫描探针显微镜可以揭示低至原子尺度的物体。冯说：“在这个尺度上，可用于从几纳米到几百纳米长度尺度的原位、动态和溶液观测的技术数量仍然非常有限，”，“这与光学成像不足有很大关系。由于光学衍射极限的分辨率。” 因此，该团队开始通过时空隔离单分子信号来研究超分辨率 ECL 成像。

       受超分辨率荧光显微镜的启发，他们采用局部空间分子反应的光学重建进行成像。这类似于人们如何通过它们的“闪烁”行为在夜间区分两颗相邻的恒星。“发光位点的空间定位和每个孤立分子反应位点框架的信息叠加构成了化学反应位点的'星座'。”

       为了证明这种成像方法的可行性和定位算法的准确性，该团队制作了一个剥离电极的图案作为已知的成像模板并进行了对比成像。单分子ECL成像结果在结构上与电镜成像结果吻合较好，验证了该成像方法的可行性。单分子 ECL 成像将传统 ECL 显微镜的空间分辨率提高到前所未有的 24 纳米。

       冯建东和他的同事继续将单分子 ECL 成像应用于细胞成像。ECL 细胞成像不需要直接标记，这可能对细胞活性比较友好，因为传统的标记过程可能会影响细胞状态。他们进一步对细胞粘附进行了单分子 ECL 成像，并观察了它们随时间变化的动态情况。通过比较相关的 ECL 成像和超分辨率荧光成像结果，他们发现 ECL 成像表现出与超分辨率荧光显微镜相当的高空间分辨率，同时可以避免使用激光和细胞标记方法。

       来自巴黎大学的Frédéric Kanoufi教授和波尔多大学的Neso Sojic教授在《自然》杂志的新闻和观点中附注：“作者的发现打开了一个新的成像概念：基于化学的超分辨显微技术，它还可能导致生物测定和细胞成像的新策略的开发，补充了成熟的基于荧光的单分子显微镜技术。”