校准光镊的简化方法

德国明斯特大学和意大利帕维亚大学的研究人员现已开发出一种简化方法来对所研究系统中的光镊进行必要的校准。研究结果已发表在《Scientific Reports》上。

活细胞内和组织内的生物力学特性在许多重要的细胞功能中起着至关重要的作用，如细胞分裂、细胞迁移、细胞分化、组织内稳态和模式。在这些特性中，粘弹性在允许细胞和组织发生适当的形状变化并相互交互方面起着关键作用。 细胞环境由一个复杂的流体组成，既有粘性又有弹性。复合流体的流变特性用复合剪切模量来表示，复合剪切模量是应力与应变之比，表示流体/材料的抗变形能力。有许多技术可以在微观尺度上探测这些性质，包括原子力显微镜、磁扭转细胞术、粒子跟踪微流变学和光镊（OT）。这些技术大多依赖于研究微米或纳米级探针粒子的位置。如果监测到探针粒子由于热作用而产生的运动，这种方法被称为被动微流变。如果监测到探针粒子在外部扰动下的运动响应，则被称为主动微流变。OT是近几十年来应用最广泛的微流变学技术之一。为了确定流变特性，OT需要精确校准。虽然研究人员已经提出了不同的被动和主动校准方法，然而，在复杂材料中，最值得注意的是所谓的主动-被动校准（APC）技术。它需要最少的先验知识，同时产生有关光阱强度（阱刚度）和所分析粘弹性介质流变特性的信息。顾名思义，APC技术结合了被动和主动测量。有源方法中的外部扰动可以通过调制俘获激光（激光驱动）或样品台（台驱动）来实现。

以不同的频率下重复主动测量，以获得所研究系统及其生物力学参数的完整特征。使用标准方法，连续频率的扫描可能需要几分钟，从而限制了该技术的时间分辨率。因此使用这种方法，在生物样品上以不同频率进行的测量可归因于不同的细胞状态，从而不允许获得特定细胞配置的可靠表征。

图注，显微镜中用光学镊子夹住的微粒。插图：固定粒子的图示；红色显示的是所使用的红外激光。来源：Pascal Runde

为了解决这个问题，已经提出了复用方法，允许显著地提高频率扫描速度。APC通常使用激光驱动方法执行，其中需要两个不同的捕获和检测激光束。在激光驱动中使用声光探测器（AOD）可以获得比通常使用压电级的级驱动更高的振荡频率。然而，代替AOD，使用空间光调制器（SLM也可以用来调制捕获激光。尽管SLMs的调制速率比AODs慢，但SLMs也可以使用，这是由于SLMs的实现相对简单，特别是如果使用高速相机而不是位置敏感光电二极管来跟踪粒子位置。尽管如此，单一激光装置的简单性使得台驱动APC的实现通常比激光驱动的APC更容易。除了激光和载物台驱动的方法外，利用高速摄影机和图像分析跟踪光学捕获的微珠已在宽频率范围内的微流变学中得到应用。尽管相机技术最近取得了进步，但检测率的典型上限仍然在kHz的数量级，而位置敏感型光电二极管可以达到MHz的数量级，这使得能够在跟踪微头位置时获得更好的时间分辨率。

为此，研究团队现在进一步改进了这种方法，使测量时间减少到只有几秒钟。他们开发了对使用样品台驱动执行的主动-被动校准技术的优化，其实施相对于需要两个不同激光束的标准激光驱动更为直接。在几秒钟内在很宽的频率范围内进行了微流变测量，实现了样品台的精确多频驱动。

简而言之，执行校准的基本程序如下：将微米或纳米尺寸的颗粒嵌入在显微镜载物台上的粘弹性样品中。样品台的快速而精确的纳米级位移导致光学捕获的粒子振荡。通过测量折射激光，可以记录样品位置的变化，这样就可以得出关于其特性的结论，例如刚度。这通常以不同的振荡频率顺序完成。

他们在很宽的频率范围内同时在多个频率上进行测量。这种多频方法可将测量时间缩短为几秒钟。该基于光镊的微流变仪首先通过测量水来验证，然后示例性地应用于更粘稠的介质，随后应用于甲基纤维素在水中的粘弹性溶液。所描述的方法为具有高时间和空间分辨率的生物样品中的微流变精密计量铺平了道路，允许研究甚至很短的时间尺度现象。因此，优化的方法提供了表征活细胞动态过程的可能性。这些不能用更长的测量来研究，因为细胞在测量过程中会自我重组并改变它们的特性。此外，测量时间的缩短也有助于降低光致加热对生物样品造成损坏的风险。