Optica：超分辨显微镜实现活体老鼠大脑内部三维成像

可视化动物大脑深处的亚细胞结构可以增进我们了解神经元在其自然环境中的运作方式。目前，得益于耶鲁大学开发的改进的超分辨率显微技术，这一想法正在逐步实现。研究人员将激发发射损耗（STED）显微镜与双光子激发（2PE）相结合，可以在三个维度上可视化活小鼠的树突棘。神经细胞上的这些微小的分支状突起在神经元与神经元的沟通中起着重要作用。研究人员使用他们的3D-2PE-STED显微镜观察了大脑深约100μm深度的棘突的形态变化。该研究目前已发表于Optica(https://doi.org/10.1364/OPTICA.416841)。

该显微镜标志着下一代3D-STED技术的发展，更重要的是，该3D技术可以提供生物组织深处埋藏的几个纳米级结构的体内视图。研究员Joerg Bewersdorf表示，以这种方式研究细胞行为的能力对于全面了解生物现象以进行生物医学研究以及药物开发至关重要。

捕捉细节

设计与体内成像兼容的显微镜比对在玻璃盖玻片上培养的细胞进行成像更具挑战性。这不仅要求光线必须穿过厚而光学密集的组织，而且任何运动（例如呼吸和心跳）都可能在图像内产生运动伪像，最终导致较差的分辨率，尤其是在轴向（z）方向上。

由Bewersdorf实验室开发的3D-2PE-STED显微镜解决了深层组织成像的两个主要障碍：光散射和光学像差，即生物组织内以及组织与物镜浸入介质之间的折射率变化产生模糊的散焦现象。为了解决光散射，研究人员结合双光子技术，使用近红外光在目标区域生成荧光信号，从而减少了光散射。同时，自适应光学器件和优化的浸没透镜可以抵消组织的光学像差，从而使光正确聚焦。在体内测试其设置之前，研究人员已使用标准2PE显微镜对系统的超分辨率功能进行了基准测试。

图像比较

像差校正的2PE-STED显微镜（中）显示了使用未校正的2PE-STED或像差校正的标准2PE成像所丢失的细胞特征。

首先，研究人员拍摄了盖玻片上培养的细胞的图像。 3D-2PE-STED系统的横向分辨率（x-y）和轴向分辨率分别为70 nm和151 nm ，这比2PE显微镜高4.2和6.5倍。当研究人员测试较厚的组织样本时，3D-2PE-STED系统的分辨能力还揭示了2PE图像中丢失的DNA中的结构细节。

然后，该显微镜的能在活老鼠的大脑内部实现了76μm的焦深。该团队成功获取了3天内单个树突棘的3D结构变化。因此，3D-2PE-STED能够观察组织变化，不仅可以观察到大脑的浅层，还可以观察到更深处的内部。

更重要的，研究人员没有发现成像导致神经元或小鼠行为的任何异常变化。他们的显微镜技术可以帮助发现在不同组织深处的大量结构和细胞之间的关系。