在过去的30年里,双光子显微镜(2PM)彻底改变了体内的功能成像技术,实现了在脑中以前所未有的规模和深度进行高空间分辨率和神经生理学记录。虽然早在20世纪90年代中期,三光子显微镜(3PM)的概念就已经被构思和证明,但3PM的优势最初并没有被充分理解。与2PM相比,3PM需要更高的激发脉冲能量和更长的激发波长,再加上对组织加热机理的研究不够深入,导致科研人员对3PM后续开发的热情不够。除了扩大了飞秒激光的波长可及性之外,三光子激发荧光在深部组织成像中的应用直到2010年才被广泛关注。2013年的两项发现为活体3PM的新发现奠定了基础:(1)用于脑深部成像的最佳激发波长约为1300 nm和1700 nm,对于现有大多数荧光探针的2PE来说,这两个波长太长了;(2) 与2PE相比,高阶非线性激励提供了数量级的更高的激励约束,这对于散射生物组织深处的高对比度成像是必要的。总之三光子显微镜(3PM)已经越来越多地用于探测神经活动,超出了典型的双光子(2PM)成像深度。
近日,康奈尔大学应用与工程物理学院Tianyu Wang和Chris Xu发表综述。该综述中,研究人员通过与2PM进行比较,阐述了长波长3PM优点和缺点。并对1300nm的3P Ca2+成像的性能优化进行了详细的讨论。同样的定量分析也适用于1700 nm 三光子激发的电压指示剂和红移钙指示剂。基于三光子成像参数对钙成像质量的影响和对脑组织的扰动,对神经成像三光子成像参数的优化进行了系统总结。此外,回顾了现有的体成像技术,并讨论了它们在深部组织中尺度三光子成像中的应用前景。相关研究工作发表在《Optica》上。(丁雷)
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文章链接:Tianyu Wang, Three-photon neuronal imaging in deep mouse Brain,Optica(2020).https://doi.org/10.1364/OPTICA.395825.